Métodos rápidos para la detección de microorganismos en alimentos

Key Concepts:

• Inocuidad alimentaria (Food safety)
• Seguridad alimentaria (Food security)
• Trazabilidad alimentaria (Food traceability)
• Métodos tradicionales vs. Métodos rápidos (Traditional methods vs. Rapid methods)
• Métodos fenotípicos (Phenotypic methods)
• Métodos genotípicos (Genotypic methods)
• Miniaturización bioquímica (Biochemical miniaturization)
• Sustratos cromogénicos (Chromogenic substrates)
• Métodos basados en antígeno-anticuerpo (Antigen-antibody based methods)
• Luminiscencia (Luminescence)
• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
• PCR en tiempo real (Real-time PCR)
• Electroforesis en gel de campos pulsados (Pulsed-field gel electrophoresis - PFGE)
• Ribotipificación (Ribotyping)
• Inmunosensores/Biosensores (Immunosensors/Biosensors)
• Microarreglos de ADN (DNA microarrays)
• MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry)

1. Antecedentes de Inocuidad Alimentaria (Food Safety Background):

• La globalización en la producción y comercialización de alimentos ha aumentado la necesidad de cumplir con requerimientos de inocuidad alimentaria tanto a nivel nacional como internacional.
• La población demanda alimentos seguros, lo que impulsa la cultura de inocuidad alimentaria.
• Es crucial conocer los conceptos de inocuidad, seguridad alimentaria y trazabilidad.
• La OMS define la inocuidad alimentaria como la garantía de que los alimentos no causen daño.
• La seguridad alimentaria se define como el acceso físico, social y económico a alimentos seguros y nutritivos.
• La trazabilidad alimentaria es la capacidad de reconstruir el proceso histórico de un producto.
• La inocuidad y la trazabilidad son fundamentales para la competitividad de las empresas y países.
• Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) son un problema de salud pública, agravado por la resistencia antimicrobiana.
• En México, se han implementado medidas para promover el consumo de alimentos inocuos.
• Existen tres tipos de riesgos en la inocuidad alimentaria: físicos (vidrio, madera), químicos (antibióticos, plaguicidas, hormonas) y biológicos (bacterias, virus, parásitos).

2. Métodos Tradicionales (Traditional Methods):

• Los métodos tradicionales son utilizados para la identificación de microorganismos y la evaluación de la calidad microbiológica.
• El proceso general incluye:
  • Enriquecimiento: Homogenización en un medio no selectivo e incubación.
  • Enriquecimiento selectivo: Uso de un medio selectivo para la bacteria de interés e incubación (24-48 horas).
  • Post-enriquecimiento: Propagación en un agar diferencial selectivo para la identificación presuntiva.
  • Confirmación: Pruebas bioquímicas o serotipificación.
• El proceso tradicional tarda entre 6 a 8 días, dependiendo del microorganismo.
• Ventajas: Efectivos, validados, sensibles y aceptados por normativas.
• Desventajas: Consumen mucho tiempo y recursos.

3. Métodos Rápidos (Rapid Methods):

• Los métodos rápidos buscan obtener resultados en un corto tiempo (minutos, horas o días).
• Incluyen medios de enriquecimiento para recuperar microorganismos viables.
• Criterios para seleccionar un método rápido:
  • Costos: Evaluar el costo-beneficio según las necesidades de la empresa.
  • Sensibilidad y especificidad: El método debe ser sensible y específico para el microorganismo de interés.
  • Tiempo: Debe proporcionar resultados en el tiempo requerido.
  • Efectividad: Debe tener una buena efectividad.
• Tipos de métodos rápidos:
  • Fenotípicos: Basados en características morfológicas, metabólicas o bioquímicas.
  • Genotípicos: Basados en el ADN.
  • MALDI-TOF MS: Basado en perfiles de proteínas.

4. Métodos Fenotípicos (Phenotypic Methods):

• Permiten discriminar entre grupos bacterianos según sus características.
• Incluyen:
  • Pruebas bioquímicas automatizadas: Kits con tiras reactivas inoculadas con la bacteria, incubación e interpretación manual o automatizada. Ejemplos: API, sistemas automatizados como VITEK.
  • Sustratos y medios modificados/especializados:
    • Petrifilm: Placas con medio de cultivo listo para inocular, incubar y contar.
    • Sustratos cromogénicos: Frascos con sustrato para identificar coliformes fecales (coloración azul) o coliformes totales (coloración amarilla).
    • Medios cromogénicos (ej., Cromagar): Permiten identificar bacterias por su coloración específica. La ISO 9308-1:2014 (calidad del agua) utiliza medios cromogénicos para aguas con baja carga microbiana.
• Ventajas de los medios cromogénicos: Similares a los sistemas tradicionales, relacionan el color con la bacteria, económicos, ahorran pasos y pueden servir como pruebas confirmatorias.
  • Métodos basados en antígeno-anticuerpo:
    • Aglutinación: Uso de perlas cubiertas con anticuerpos para aglutinar la bacteria. Ejemplos: kits para E. coli O157:H7 y Salmonella.
    • Separación inmunomagnética: Uso de perlas magnéticas específicas para capturar la bacteria, seguida de separación magnética.
    • Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA): Uso de sondas marcadas inmovilizadas en placas, lavados y lectura en un lector de placas.
  • Luminiscencia: Uso de hisopos para detectar ATP en superficies, indicando la presencia de células.

5. Métodos Genotípicos (Genotypic Methods):

• Basados en el ADN.
• Uso de sondas: Complementariedad entre bases del ADN del microorganismo y sondas marcadas (luminiscencia o fluorescencia).
• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):
  • PCR Punto Final: Desnaturalización, alineamiento de primers y extensión. Visualización mediante electroforesis en gel de agarosa.
  • PCR en Tiempo Real: Uso de una sonda marcada que emite fluorescencia al romperse durante la extensión. La fluorescencia se registra en un detector.
• RT-PCR (PCR transcriptasa reversa): Utilizada para virus de ARN.
• PCR con separación inmunomagnética: Combinación de perlas inmunomagnéticas y PCR.
• Comentario importante: Los métodos genotípicos pueden identificar bacterias viables (si se parte de un enriquecimiento) o viables y no viables (si se parte directamente de la muestra).
• Electroforesis en gel de campos pulsados (PFGE): Utilizada para trazabilidad y estudios epidemiológicos.
• Ribotipificación: Identificación de secuencias altamente conservadas para clasificar bacterias.

6. Inmunosensores/Biosensores (Immunosensors/Biosensors):

• Dispositivos compactos que incorporan un elemento de reconocimiento biológico (ácido nucleótido, anticuerpo, tejido, célula, enzima) asociado a un sistema de transducción.
• Detectan hasta 10^3 células en 24 horas (incluyendo el enriquecimiento).
• Ejemplo: Espectroscopia láser.

7. Microarreglos de ADN (DNA Microarrays):

• El ADN se pone en laminillas con microorganismos fijados.
• El ADN extraído hibrida con el ADN complementario en la laminilla.
• Se mide la fluorescencia para determinar la presencia y actividad de los genes del microorganismo.

8. MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry):

• Identifica bacterias mediante perfiles de proteínas.
• Mide la relación masa/carga de fragmentos generados durante la reacción.
• Compara el espectro de la bacteria con bibliotecas de microorganismos.
• Identifica cualquier bacteria en menos de 5 minutos (sin contar el enriquecimiento).

9. Conclusión (Conclusion):

La presentación aborda una amplia gama de métodos rápidos para la detección de microorganismos en alimentos y aguas, desde técnicas fenotípicas sencillas hasta métodos genotípicos y espectrométricos avanzados. Se enfatiza la importancia de seleccionar el método adecuado según las necesidades de cada empresa, considerando factores como el costo, la sensibilidad, la especificidad y el tiempo de respuesta. Se destaca la necesidad de validar los métodos rápidos y compararlos con las normativas existentes para garantizar su fiabilidad y aplicabilidad. La presentación proporciona una visión general completa y detallada de las herramientas disponibles para la detección rápida de microorganismos, lo que permite a las empresas tomar decisiones informadas para garantizar la inocuidad alimentaria.