Práctica 2: Técnicas Básicas de Inoculación

Técnicas Básicas de Inoculación en Microbiología e Inocuidad de Alimentos

Key Concepts:

Inoculación: Transferencia de microorganismos de un medio a otro.
Esterilización: Eliminación de microorganismos para evitar contaminaciones.
Asa de Nicromo: Instrumento utilizado para la transferencia de microorganismos.
Medios de Cultivo: Sustancias que proporcionan nutrientes para el crecimiento microbiano (líquidos, sólidos, semi-sólidos).
Estría: Técnica de siembra para aislar colonias.
Hisopado: Técnica de siembra para cubrir una superficie con microorganismos.
Turbidez: Opacidad en un medio líquido indicativa de crecimiento microbiano.
Colonias Aisladas: Poblaciones de microorganismos genéticamente idénticos separados en un medio sólido.
Carga Microbiana: Cantidad de microorganismos presentes en una muestra.
Medios Selectivos: Medios de cultivo que favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos e inhiben el de otros.
Movilidad: Capacidad de un microorganismo para desplazarse en un medio.
Swarming: Crecimiento extensivo y rápido de algunas bacterias, como Proteus, en medios sólidos.

1. Preparación y Rotulación

Rotulación: Es crucial rotular los medios de cultivo con información relevante:
- Cepa utilizada (ej., Serratia marcescens).
- Fecha de inoculación.
- Medio de cultivo.
- Iniciales del inoculador.
Ubicación del Rótulo: El rótulo debe colocarse alrededor de la placa o en la parte posterior del tubo, nunca en el área de observación o en la etiqueta del tubo.

2. Inoculación desde un Medio Líquido

Homogeneización: Utilizar un vortex para homogeneizar el cultivo líquido durante 7 segundos.
Toma del Inóculo: Esterilizar el asa de nicromo y tomar una "gota convexa" (una gota atrapada dentro del asa, no una película).
Inoculación en Placa de Agar (Estría):
1. Extender el inóculo en una pequeña área para secar.
2. Realizar una primera estría desde el área seca hacia abajo.
3. Esterilizar el asa.
4. Realizar una segunda estría desde la primera, diluyendo el inóculo.
5. Repetir el proceso, esterilizando el asa entre cada estría para diluir progresivamente el inóculo y obtener colonias aisladas.
Inoculación en Tubo de Agar Inclinado (Estría):
1. Realizar una línea en la superficie del bisel.
2. Realizar una estría a partir de la línea.
Inoculación en Caldo (Medio Líquido):
1. Inclinar el tubo de caldo.
2. Introducir el asa con el inóculo lo menos posible.
3. Descargar la gota en el líquido.
4. Flamear el tubo antes y después de la inoculación.

3. Inoculación por Hisopado

Preparación: Utilizar un hisopo estéril y un tubo con diluyente ajustado a 0.5 en la escala de McFarland.
Toma del Inóculo: Introducir el hisopo en el tubo con el inóculo, escurriendo el exceso contra la pared del tubo al retirarlo.
Siembra: Sembrar en tres direcciones sobre la superficie de la placa:
1. Horizontal.
2. Vertical.
3. Diagonal.
Desecho: Desechar el hisopo en un contenedor adecuado para su posterior esterilización.

4. Inoculación desde un Medio Sólido

Toma del Inóculo: Tomar una cantidad mínima de biomasa de la colonia deseada.
Inoculación en Caldo: Similar al proceso desde un medio líquido, pero asegurándose de tomar una pequeña cantidad de biomasa.
Inoculación en Agar Inclinado (Picadura y Estría):
1. Utilizar un asa de picadura esterilizada.
2. Realizar una punción vertical en el centro de la colonia.
3. Inocular el agar inclinado con una pequeña descarga.
4. Realizar una picadura vertical en el agar.
5. Realizar una estría en la superficie del bisel.
Inoculación en Medio Semi-Sólido (Picadura):
1. Realizar una punción vertical en el centro de la colonia.
2. Picar el medio semi-sólido exactamente en el centro, entrando y saliendo en la misma línea.

5. Consideraciones para la Técnica de Estría

Objetivo: Aislar colonias para obtener cultivos puros.
Factores a Considerar:
- Cantidad de microorganismos en la muestra.
- Tipo de medio de cultivo.
Número de Esterilizaciones del Asa: Ajustar el número de esterilizaciones del asa según la carga microbiana esperada:
- Alta Carga: 3 esterilizaciones.
- Carga Intermedia: 2 esterilizaciones.
- Carga Baja: 1 o ninguna esterilización.
Medios Selectivos: Utilizar menos esterilizaciones si se utilizan medios selectivos.

6. Tabla de Esterilizaciones Recomendadas

7. Resultados y Consideraciones

Caldo: El crecimiento se observa como turbidez.
Agar Inclinado: El crecimiento se observa en la superficie del bisel.
Medio Semi-Sólido:
- Movilidad Positiva: Turbidez en todo el medio.
- Movilidad Negativa: Crecimiento restringido a la picadura.
Placas de Agar (Hisopado): Se busca un crecimiento homogéneo en toda la superficie.
Placas de Agar (Estría): Se buscan colonias aisladas.
Contaminación: Identificar y aislar colonias contaminantes.
Crecimiento de Proteus: Proteus puede presentar un crecimiento extensivo (swarming) que dificulta el aislamiento de otras colonias. Utilizar medios selectivos o agentes inhibidores para controlar su crecimiento.

8. Ejemplos de Crecimiento Microbiano

Serratia marcescens: Colonias rojas distintivas.
Proteus: Crecimiento extensivo (swarming) en forma de anillos concéntricos.
Listeria monocytogenes: Movilidad en forma de paraguas en medios semi-sólidos.
Salmonella: Colonias rosas en agar verde brillante (si no fermenta lactosa).

9. Errores Comunes

Tocar las estrías entre sí: Esto impide la dilución adecuada del inóculo.
Exceso de inóculo: Puede resultar en un crecimiento excesivo y dificultar el aislamiento de colonias.
Mala técnica de picadura: Puede confundir la interpretación de la movilidad en medios semi-sólidos.

10. Síntesis/Conclusión

Las técnicas básicas de inoculación son fundamentales en microbiología para el aislamiento, identificación y estudio de microorganismos. La correcta aplicación de estas técnicas, incluyendo la esterilización adecuada, la selección del medio de cultivo apropiado y la consideración de la carga microbiana, es esencial para obtener resultados precisos y confiables. La experiencia práctica y la observación cuidadosa de los resultados son clave para perfeccionar estas habilidades.